EXCLUSIV Geneticiana Florina Raicu explică etapele testului pentru coronavirus, dependența totală a României de producători străini de aparate și kit-uri, plus problema majoră a resursei umane necesare pentru creșterea numărului de testări

Florina Raicu, cercetător genetician și asistent universitar la UMF Carol Davila, a explicat într-un interviu pentru G4Media.ro care sunt etapele obligatorii în realizarea unui test pentru detectarea coronavirusului și de ce România depinde exclusiv de producători străini de aparate și kituri necesare pentru testare.

Geneticiana Florina Raicu, doctor în genetică moleculară la Universitatea G.’Annunzio Chieti – Pescara, a explicat de ce este necesar un număr cât mai mare de teste: ”este crucială pentru că astfel înțelegem cum evoluează boala și pentru a reduce rata infectării”.

O altă problemă, pe lângă lipsa materialelor necesare, este cea a specialiștilor. Instruirea rapidă a unor noi operatori prezintă riscul lucrului sub presiune, ceea ce ar putea duce la îmbolnăvire, contaminare de probe și analize false.

Carte de vizită Florina Raicu:

– UMF Carol Davila Bucuresti, Facultatea de Medicina Generala, Catedra de Genetica Medicala – asistent universitar

– Institutul de Antropologie Francisc J. Rainer al Academiei Romane Bucuresti – cercetator stiintific

– Doctor in medicina “Magna Cum Laude” Institutul de Antropologie Francisc J. Rainer al Academiei Romane, Bucuresti

– Doctor in genetica moleculara, calificativul “Eccellente”, Scoala doctorala internationala “Functional Neuroimaging: from cells to systems”, Institutul de Tehnologii Biomedicale Avansate, Departamentul de Stiinte Clinice si Bioimaging, Universitatea G.’Annunzio Chieti – Pescara ITALIA.

• Interviul integral:

Rep: Cum se face un test pentru coronavirus, care sunt etapele?

Florina Raicu: Pentru testarea prezentei SARS-CoV-2 în primul rând, este nevoie întotdeauna un spațiu de lucru adecvat, fiind vorba de virusuri, pentru a se putea respecta doua cerințe obligatorii: evitarea infectării personalului și evitarea contaminării probelor intre ele în timpul lucrului și/sau între diverse runde de testare (rezultate fals pozitive). Acest spațiu necesită cel puțin 3 camere separate: una pentru pregătirea probelor, una pentru pregătirea reactivilor și una pentru analiza propriu-zisă (cea cu aparatele faimoase ce urmează să se achiziționeze). Citez din broșurile pentru kiturile de testare: „Use separated working areas for specimen preparation, reaction set up and amplification”.

Apoi cerințele obligatorii sunt cele conform cărora probele trebuie manipulate într-un spațiu de tip Biosafety Level 2 conform ghidurilor World Health Organization emise la 12 Feb 2020.

„Warning and Precautions: Testing for the presence of COVID-19 should be performed in appropriately equipped laboratories by staff trained in the relevant technical and safety procedures. National guidelines on laboratory biosafety should be followed in all circumstances” (in cazul de fata trebuie respectate cerințele autorității nationale RENAR)

Etapele de lucru generale ar fi următoarele:

1. Se recoltează steril proba biologica cu ajutorul swab-ulrilor din faringe, în general, sau din saliva.
2. Proba se duce la laborator unde, în prima etapă se resuspendă proba într-un mediu și apoi se realizează inactivarea virusului cu trizol.
3. Urmează etapa de izolare a acizilor nucleici, în cazul de față molecule ARN printre care, alături de cele umane se află și cele de origine virală. Fiind vorba de un virus ARN ar fi nevoie de kituri de izolare a ARN. Această etapă se poate face manual sau, în mod automat, dacă există astfel de echipamente în dotarea laboratoarelor. În general, nu cred că au astfel de echipamente prea multe laboratoare din țară pentru ca sunt echipamente costisitoare.
4. ARN-ul izolat este revers transcris în ADN complementar.
5. Urmează analiza propriu-zisa Real Time PCR pentru detecția prezenței virusului. Se face în aparatul numit Real Time PCR prin metoda de detecție cu sonde TaqMan.

Trebuie înțeles cumva de către nespecialiști următorul lucru: in cazul in care virusul este prezent in proba, prin aceasta tehnica se poate ca un fragment redus ca dimensiune din genomul viral (un fel de secvență proprie numai acestui tip de virus), în cursul procesului artificial de „înmulțire” a numărului de copii, să poată fi detectat automat în prezența unor molecule sintetice marcate fluorescent care se asociază cantitativ cu numărul progresiv de ampliconi generați.

Aici, dacă este necesar, pot sa fac o paranteză pur tehnică pentru explicarea principiului metodei, deși nu cred că e nevoie.

Rep: Care sunt echipamentele de care e nevoie pentru un test?

Florina Raicu: S-a vehiculat ideea achiziționării a zeci de echipamente Real Time PCR. Nu știu exact la ce tip anume instrumente se referea dl. prim-ministru.

Pentru testarea Covid-19 kiturile și aparatele trebuie să aibă IVD pentru a putea furniza rezultate. De la declanșarea epidemiei a existat o cursă contra cronometru pentru obținerea certificărilor IVD din partea producătorilor de echipamente și kit-uri.

Pentru echipamente nu știu pentru ce variantă se optează.

Varianta 1

Există varianta echipamentului produs de francezii de la EliTech Group care este complet automatizat – Elite InGenius Platform – fiind vorba de o platformă, dar care lucrează exclusiv cu kituri de detecție produse special. Adică este un sistem închis. Abia au obținut aprobare pe 3 martie pentru IVD (in vitro diagnostic) pentru kit-ul lor GeneFinder COVID-19 Plus RealAmp Kit produs de cei de la OSANGHealtcare special pentru platforma automatizată. Acestă platformă lucrează direct cu tuburile primare! Costă aproximativ 50000 euro din cate știu. Se merge pe varianta montării în containere a întreg sistemului, din cate am înțeles. Nu știu însă cu ce abateri de la norma privind spațiul de lucru.

Kitul acesta se poate utiliza și in combinație cu alte tipuri de instrumente RT-PCR din fericire!

Varianta 2

Daca se lucrează pe varianta standard, e nevoie de mai multe instrumente în afara de echipamentul propriu-zis de detecție (RT-PCR). Adică, fie se izolează acizii nucleici cu un extractor automat (de dorit si cu manipulare redusa), fie se izolează manual, caz în care este nevoie de centrifuga de mare viteza, vortex, micropipete, termobloc.

Repet, oricum pentru ambele variante trebuie să existe spațiul adecvat. Și cel puțin o hotă cu exhaustare.

Rep: De ce sunt doar șapte centre în care se fac aceste testări?

Florina Raicu: Pentru ca acesta a fost probabil necesarul de până acum.

Din câte am înțeles, acum există o mare presiune pentru efectuarea acestor testări. În general, exista o problemă legată, în special, de calitatea diferita a pregătirii celor care se pot, tehnic și teoretic, ocupa de aceste testări. Din păcate, sunt foarte mulți medici care au în continuare impresia că testarea se face cam că la biochimie: bagi proba în aparat și scoți rezultatul gata imprimat, numai bun de stampilat și semnat. Au și anunțat că o pot face, punând astfel presiune pe cei în a căror sarcină ar reveni astfel de testări: în general biologi și biochimiști.

Există o mare problemă deja între aceste două bresle, pentru că biologii și biochimiștii sunt deja încărcați cu alte feluri de analize și sunt de trei ori mai prost plătiți. Din păcate, medicii nu se vor „coborî” la munca de jos. În multe centre, din păcate aceste teste se fac chiar de către asistenți medicali sau alți tehnicieni. Chiar și lucrul cu noua platformă, complet automatizată, necesită personal calificat pentru că rezultatul dat de instrument trebuie interpretat.

Rep: Având în vedere evoluția epidemiei în Europa și numărul mare de români veniți acasă, e suficient numărul de testări realizate până în prezent?

Florina Raicu: Testarea este de o importanță deosebită. Coreea de Sud fix asta a făcut de la momentul T₀ și are cea mai mică rată de îmbolnăvire, pentru ca a cuplat testarea cu izolarea. Trebuie să se cunoască precis numărul de persoane infectate și de aceea este util să se facă testare pe scară largă.

Când testarea se face la un nivel redus nu se poate obține o imagine obiectivă a fenomenului aflat în desfășurare. Este crucială pentru că astfel înțelegem cum evoluează boala și pentru a reduce rata infectării.

Rep: Apar tot mai multe informații despre lipsa kiturilor de testare. Care poate fi motivul? Costă mult, sunt greu de procurat?

Nu știu exact care este situația legată de „lipsa kiturilor”. Există o cerere destul de mare la nivel mondial, iar producătorii cu IVD sunt puțini. Compania coreeană SeeGene și-a mărit producția de kituri angajând voluntari în fabrică. Și ei nu au fost considerați ca fiind printre producătorii cei mai buni si nu stiu dacă au certificările necesare. Au cereri din 30 de țări. Fac kituri 10.000 pe săptămâna, fiecare kit pentru 100 probe. Costa aproximativ 20 dolari testul. Din nefericire, Romania nu are o astfel de companie care să fabrice kituri.

Pentru sistemele deschise de analiza Real-Time se pot utiliza kit-uri de la PrimerdesignTM Ltd  – Genesig Coronavirus (COVID-19) 1.0 Real-Time PCR Assay,  precum si cel produs de Qiagen QIAstat-Dx Respiratory 2019-nCoV Panel. Nu stiu exact cat costa si ce capacitați de producție au exact. Oricum, sunt mai scumpe decât cele de la SeeGene.

Rep: De ce e nevoie acum pentru a mări numărul de teste? De aparate Real Time PCR, de kituri, de specialiști? Cum se poate rezolva penuria, dacă e vorba de o penurie?

Nu știu cum ar putea fi instruit personalul nou ca să facă astfel de testări (pe care să te poți baza) într-un timp atât de scurt. Trebuie recrutați din rândul celor cu minime deprinderi de biologie moleculară. Personal am îndoieli, pentru că pregatirea deprinderilor de lucru necesită un timp minim. Nu mi se pare o variantă optimă, deoarece vor lucra sub presiune și vor gresi. Orice greșeală înseamnă contaminare de personal și implicit îmbolnăvire, contaminare de probe și kituri și, implicit, analize false și pierderi financiare prin deteriorarea kiturilor și instrumentelor.

Nu poti lasa baltă analizele de rutina ca să faci doar Covid-19. Cei care au expertiză trebuie degrevați de la sarcinile de rutină. De către cine?

Dacă creștem numărul de aparate asta înseamnă două lucruri: aparatul ajunge la cei care deja fac analizele și crește sarcina de lucru, sau se creeaza spații noi, dar care trebuie deservite de alte persoane nou instruite.

Depindem exclusiv de producătorii mondiali de kituri si echipamente.

Foto: Arhiva personală